反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用*泛的技術，主要是因為它適用于分析絕大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。
 

　　如果污染是因為重復進樣時強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的清洗步驟來除去這些污染物往往就能恢復其色譜性能。經(jīng)過等度運行后的高效液相色譜柱，有時用90～100%含量的溶劑B(雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等)沖洗20個柱體積可以清除污染物(色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml)。
 

　　如果使用的是緩沖鹽系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會導致更大的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應該先用無緩沖鹽流動相(即把緩沖液換成水)，沖洗5～10個柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
 

　　有時候，強溶劑B也沒法把殘留在高效液相色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。
 

　　如果污染物不是生物質(zhì)的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問題。柱子生產(chǎn)廠家的網(wǎng)頁和產(chǎn)品說明書上很多也有清洗方法推薦。
 

　　所有的清洗方法的模式普遍都類似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個溶劑往往是非極性(疏水性)很強的(如醋酸乙酯甚至是烷烴)，以便于溶解脂質(zhì)、油類等非極性污染物。溶劑系列中每個溶劑都保證能與下一個溶劑互溶。
 

　　整個清洗過程結束后，在回到原來的流動相體系前，必須借助一個中等強度的互溶性非常好的溶劑過渡。例如， 異丙醇是一個非常好的過渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。